الکتروفورز استات _سلولز سیترات آگار

الکتروفورز استات _سلولز سیترات آگار

فرمت: pdf  تعداد صفحات:13

الکتروفورز

الكتروفورز عبارت است از حركت يك جسم باردار در يك ميدان الكتريكی درPHمعين.

پروتئين ها درPHايزو الكتريك خود دارای بارهای منفی ومثبت برابرند، بنابر اين درPH قليائی دارای بار منفی شده وبطرف قطب مثبت حركت می كنند. در طی اين حركت جدا سازی صورت ميگيرد. هموگلوبين نرمال در افرادبالغ(HbA)،در بافر قليايی دارای شارژ منفی است و به طرف آند حركت می كند .

جداسازی بيشتر انواع هموگلوبين های غيرطبيعی ازهموگلوبينAبدليل ساختمان غير طبيعی آنها كه معمولا”يك آمينواسيد جايگزين آمينو اسيد ديگرشده است ، بر اساس تغيير در شارژ الكتريكی شان صورت می گيرد.

جدا سازی الكتروفورتيك روشی ساده برای شناسائی مقدماتی بسياری از هموگلوبين ها می باشد.

الکتروفورز استات سلولز جهت بررسی هموگلوبینوپاتیها :

انواع مختلف حامل(Supporting media)وجود دارد كه حامل های سلولزی از متداول ترين آنها می باشد.

مزايا: سهولت استفاده ،جدا سازی سريع هموگلوبين هایC و S، F ،A(با جذب كم)،حمل آسان ونگهداری طولانی مدت با قرار دادن در كيسه پلاستيكی

معايب: عدم شناسائی اجزائی از هموگلوبين با غلظت كم،عدم جدا سازی همه انواع هموگلوبين بخصوص هموگلوبين های ناپايدار.هم چنين هموگلوبين هایA و Fدر كنار هم جدا می شوند كه ممكن است مقادير كم هر يك دربرابر مقدار بالای ديگری قابل جدا سازی نباشند.

• آماده سازی نمونه

-نمونه مورد استفاده در الكتروفورز ، هموليزات است كه ترجيحا” از گلبولهای قرمز شسته شده تهيه می شود. يك جداسازی خوب الكتروفورتيك ، عموما” از هموليزاتی با غلظت هموگلوبين در محدوده2-3گرم در دسی ليتربدست می آيد.

-ضد انعقاد مصرفیCPD , ACD , EDTAیاHeparinمی باشد وخون دردمای 4درجه به مدت 10 روزقابل نگهداری است.(خون های هپارينه در طول نگهداری ممكن است تشكيل لخته های بسيار كوچك بدهند.)

-در صورت استفاده از كيت، مطابق با دستورالعمل آن عمل كرده و از محلول ليزكننده داخل كيت جهت تهيه هموليزات استفاده می كنيم .

-در صورتيكه بيمار مشكوك به يك هموگلوبينوپاتی از نوع ناپايدار باشد ، سلولها فقط بايد با آب مقطر ليزگردندو از حلالهای آلی جهت تهيه هموليزات نبايد استفاده شود چون باعث رسوب وتغيير ماهيت اين هموگلوبين هاميشود.

• تجهیزات

1. مخزن الكتروفورز : دارای مخازن نگهداری بافروپل هايی است كه استات سلولز روی آن قرار می گيرند.
2. منبع تغذيه : بايد دستگاه يك ولتاژ ثابت جريان مستقيم داشته باشد و دارای اتصال زمين باشد تامانع شوك به كاربر شود. مجهز به تايمر60-0دقيقه ، قادر به تأمين ولتاژ450و كليد قطع ووصل اتوماتيك باشد ، بطوری كه تا قطع كامل جريان برق امكان باز نمودن درب مخزن وجودنداشته باشد.
3. محيط استات سلولز : بايد با اطمينان از عدم پارگی محيط(Medium)به آن دست بزنيم.معمولا” استات سلولز به يك ورقه پلاستيك متصل می شود.
4. اپليكاتور: نمونه گذاری ميتواند با هر وسيله مناسبی كه بتواند 5، μl 1-0 از نمونه را در سطح محيط قرار دهد انجام گيرد . مقادير نمونه گذاری شده بايد يكسان باشد.
5. بافرTEB-اين بافرعموما” در محدوده4/PH =9/2-8استفاده ميشود بافر مرسوم دارایPH=8/4است.

• طرز تهيه بافر Tris – EDTA – Boric Acid ( TEB ):

-پودر تريس هيدروكسی متيل آمينومتان10/2گرم

– EDTA←  گرم0/6

-اسيد بوريك←   3/2گرم

-آب مقطر تا حجم←1000 میلی لیتر

بافر فوق تا قبل از كدورت و تغيير رنگ در دمای 4 درجه قابل مصرف است.

• رنگ

در الكتروفورز استات سلولزمی توان از هر نوع رنگ آميزی مناسب پروتئين ها استفاده نمود. به طور اعم با رنگ( W/V ) S  Panceau  0/0-0/3 درصد كه دارای 5 درصد(W/V) تری كلرواستيك اسيد می باشد نتايج خوبی مشاهده می گردد.

– پانسو ، 500-300 میلی گرم

-تری كلرو استيك اسيد ، 5 ميليگرم

-آب مقطر تا 100 ميلی ليتر

-Counter staining: جهت افتراق پروتئين های هم از غير هم(Hem)،نوار را می توان با يك رنگ ويژه هم(Hem)، Counter stainكرد . برای اين منظور از بنزيدين استفاده می شود كه بدليل كارسينوژنيك بودن آن ساير رنگهای ويژه هم(Hem)مانند:

O-tolidine dihydrochloride

dianisidine ( 3 , 3´ dimethoxybenzidine )-O
نيزتوصيه می شود.

• محلول های رنگ بر ، آب گیر ، شفاف کننده

1. اسيد استيك(V/V)5-3درصد  (رنگ بر )
2. متانول95-100درصد   (آبگیر)
3. اسيد استيك در متانول (V/V) 20درصد   (شفاف کننده)

با چند بار تعويض در اسيد استيك3-5درصد ، زمينه را بی رنگ كنيد.

• روش کار

روش كار بر اساس دستور العمل هر توليدكننده صورت می گيرد. مراحل زير بطور معمول در اكثر روش ها اجرا می شود:

1. نوار استات سلولز را به آرامی در بافر فرو ببريد تا از ايجاد حباب هوا جلوگيری كند.(اشباع كردن در بافر)
2. دو مخزن تانك را به طور مساوی با بافر پر كنيد.
3. نوار اشباع شده را از بافر خارج نموده و به سرعت بين دو ورقه كاغذ جاذب الرطوبت قرار داده ورطوبت اضافی را به طور يكنواخت بگيريد.
4. نمونه های هموليزات را بر روی استات سلولز ، در طول يك خط و در فاصله يك سوم طول ورقه از لبه كاغذ قرار دهيد. نتايج خوب عموما” با مقادير0/5-1ميكرو ليتراز هموليزات مشاهده می شود.
5. نوار استات سلولز را طوری بر روی پل مخزن قرار دهيد كه محل نمونه گذاری به كاتد نزديكتر باشد.
6. مطمئن شويد سمت استات سلولزنوار به طرف بافر(پائين) است.
7. ولتاژ250-400 ولت(عموما” 300) را در زمان مورد نظر برقرار كنيد .(بسته به نوع و اندازه نوار استات سلولز و كارخانه توليدكننده متغير است.)
8. پس از زمان مورد نظر ، نوار را از مخزن بيرون آورده ، بر اساس دستور العمل درون كيت رنگ آميزی ،شفاف و خشك كنيد.

• ملزومات حرکت

*كنترل

در هر بار الكتروفورز استات سلولز بايداز يك نمونه كنترل حاوی هموگلوبين هایA , F , S , C دركنار نمونه های بيماران استفاده نمود..

-نوسانات كم جريان برق ، شماره سريالهای مختلف بافر ونوار استات سلولز ، ممكن است سبب تغييرات كم درسرعت حركت در الكتروفورز شود.

-الگوی حركت نمونه های مجهول را بايد با هموليزات نمونه كنترل درهمان نوار مقايسه نمود.

*جدا سازی

با هر شماره سريال جديد استات سلولز ، نمونه هايی كه حاوی تركيبي از هموگلوبين هایF , S و F , A هستند بايد نمونه گذاری شوند و جداسازی مناسب هموگلوبين ها بر روی نوار استات سلولز آزمایش شود. تفكيك واضح اين هموگلوبين ها بايد با يك ناحيه شفاف كوچك بين آنها مشخص شود. ممكن است لازم باشد غلظت هموگلوبين ها را در نمونه كاه داده يا زمان و ولتاژ را جهت مشاهده تفكيك دقيق باندها تنظيم شود.

• فتوتیپ

منظوراز فنوتيپ، هموگلوبين های عمده ای است كه به فرم باند مجزا درالكتروفوراستات سلولز قابل مشاهده می باشند.

-در گزارش هموگلوبينوپاتی ها ، هموگلوبينی كه غلظت آن بيشتر است ، ابتدا نوشته می شود. وقتی غلظتHbA بيشتر است ، الگوی فرم هتروزيگوت آن مثلا” در سيكل سل هتروزيگوت ياHbCهتروزيگوت به صورتHbACیاHbASنوشته ميشود.

-اگر دو نوع هموگلوبين تقريبا” در مقادير مساوی حضور داشته باشند. آن يكی كه از نظر بالينی اهميت بيشتری دارد اول نوشته می شود. مثلا(HbSC)

ادامه مطلب رابادانلود فایل پیوستی مشاهده کنید: